pSC101质粒有可插入外源DNA的多个内切酶单克隆位点和四环素抗性强选择记号，是第一个真核基因克隆载体。
缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
2）ColE1质粒载体
ColE1质粒属于松弛型复制控制的多拷贝质粒。正常生长条件下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在对数生长末期的细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。
松弛型复制控制的质粒DNA仍然可以继续进行复制达数小时之久，使每个寄主细胞中所累积的ColE1质粒拷贝数增加到1000-3000个之多，质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。
3）pBR322质粒载体
由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。
优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。
具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
将外源DNA片段克隆在pBR322质粒的BamHI或SalI位点上，由于阻断了tetr基因编码序列的连续性，使其失去活性，产生了具有AmprTets表型的重组的pBR322质粒。
4）pUC质粒载体（包括四个部分）
(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；
(iv)位于lacZ ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ ’基因的功能。
优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。
可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ'基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。
具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。
5）pGEM-3Z质粒
长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。
含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。
6）穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）
指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。
5. 3. 3 λ噬菌体载体
噬菌体可在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞，就既不能生长也不能复制，因为大多数的噬菌体只能利用寄主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。
分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。
在溶菌周期，噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。
溶源生长周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA被整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫作温和噬菌体。
λ噬菌体的分子量为48.5kb，是温和噬菌体。
λ噬菌体有61个基因，其中约一半参与了生命周期的调控，是λ噬菌体的必需基因；另一部分基因则被称为非必需基因，被外源基因取代后不影响生命周期。
在λ噬菌体线性DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的完全互补的5‘突出序列（即粘性末端），注入到寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子，并进一步超盘绕。
这种粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（cohesive-end site）。
5. 3. 5 pBluescript噬菌粒载体
pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。
(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；
(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；
(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；
(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。
5. 4 基因的分离与鉴定
在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。
在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。
在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。
基因克隆，包括目的基因的分离和鉴定两个内容，分四个基本步骤：
(1) DNA材料的选择与片段化；
(2) 外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；
(3) 将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；
(4) 重组转化子克隆的选择或筛选。
5. 4. 1 DNA片段的产生与分离
由于高等真核生物的基因组庞大，按一般载体承受外源DNA插入能力（大约为1000~3000bp）计算，能产生几十万个大小不同的DNA片段，形成由几十万个大小不同的重组体分子组成的克隆群体。
5. 4. 2 重组体DNA分子的构建
1)外源DNA片段定向插入载体分子
用两种不同的限制性核酸内切酶同时消化特定的DNA分子，将产生不同粘性末端的DNA片段。如果载体分子和待克隆的DNA分子都用同一对限制性核酸内切酶切割，载体和外源DNA片段将按一种取向连成重组DNA分子，保证外源DNA片段定向插入载体分子。
载体分子和外源DNA插入片段（或称供体DNA），并不一定总能产生出互补的粘性末端，所以，有时采用平末端连接法或采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。
2)重组子导入受体细胞的途径
将外源重组体分子导入受体细胞的主要途径包括转化（或转染）、转导、显微注射和电穿孔等。转化和转导主要适用于细菌一类原核细胞和酵母等低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动物的真核细胞。
5. 4. 3 cDNA基因克隆
真核生物基因组庞大，含有大量重复序列。无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法，都难以直接分离到目的基因片段。
尽管高等生物一般具有3-5万种左右不同的基因，在单个细胞或组织的特定时间段中，仅有15-20%左右的基因得以表达。
cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。
可应用Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。
低丰度mRNA，每个细胞仅有14个拷贝左右，其总量约占总mRNA的30%，其中约有11000个左右的不同种类的mRNA。为了获得能够代表全部低丰度mRNA序列的cDNA基因文库，理论最低克隆数是11000/0.30=~37 000。实验中为使低丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期望率，需要筛选170 000个克隆子。
5. 4. 4 克隆基因的分离
1)应用核酸探针克隆目的基因。
把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。
2)应用mRNA差别显示技术克隆目的基因。
不同基因在生物个体发育的不同阶段或不同的组织、细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differential expression）。
1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的科学家P. Liang和A. D. Pardee发明了mRNA的差别显示（mRNA differential display）技术，简称DDRT-PCR，可以从一对不同基因型的细胞群体所产生的约15 000种mRNA中有效地鉴定并分离出差别表达的基因。
设计合成了12种由11个或12个连续的脱氧胸苷酸加上两个3‘-端锚定脱氧核苷酸组成的3'引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。每一种人工合成的寡核苷酸引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂合分子。
在DDRT-PCR反应中，常用3'-端锚定引物和8-10-mer的5'-端随机引物组成的引物对，以第一链cDNA为模板进行PCR扩增（图5-29）。
3)应用RDA法进行分子克隆
该法通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。
每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高（图5-30）。
4) 应用酵母双杂交体系（Two-hybrid system）克隆基因
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，AD则推动了转录起始。
5) cDNA RACE(cDNA末端快速扩增)
是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。
6) 基因的图位克隆法（Map-based cloning）
所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。
根据基因功能互作原理鉴定目的基因。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cm≈1000kb；拟南芥菜中， 1cm≈290kb；小麦中，1cm≈3500kb。
5. 4. 5真核基因表达研究方法与应用
1)基因敲除技术(Gene Knockout)
2)蛋白质相互作用（Pull-down assay）
3)导弹药物——药物导向治疗
肿瘤或癌细胞表面常过量表达某些特征性蛋白质，可作为肿瘤导向治疗的作用靶。将抗体的某些部分与外毒素相连接，就能把毒素直接送到病变细胞表面，有效地杀死病变细胞，保护健康细胞。
4) 用DNA微列阵技术(DNA Microarray) 进行基因克隆
最简单的例子是用机械手把极微量（nanoliters）的已经除去中等或高度重复序列的DNA样品点到玻片或其它载体上并使之永久固定，用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任何时期特异表达的基因。
若把某一生物体内全部基因分别点到DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性。