研究表明，反转录病毒有致癌作用，其基因组含癌基因（oncogene，onc）。正常人的细胞基因组含原癌基因（pro-onc），在胚胎发育期有明显的表达，而成年个体极少表达。当一些化学致癌物诱发这些基因表达时，细胞将发生癌症（白血病等）。1983年发现的HIV是一类反转录病毒，感染人的T淋巴细胞即杀死细胞，造成人的免疫系统损伤，引起AIDS。

第三节   DNA损伤与修复
DNA复制的保真性是维持物种相对稳定的主要因素，而DNA复制时的错误是突变（mutation）发生的原因。突变是生物进化和细胞分化的分子基础。所以遗传的稳定性和突变的绝对性组成生物界对立统一的自然现象，使生物世界五彩缤纷。
一、DNA突变和损伤的概念
突变是指DNA分子碱基的改变或表型功能的异常变化。是通过复制而遗传给子代的永久性DNA序列的改变，逃脱或躲过细胞修复系统。DNA损伤通常指DNA序列可修复的变化（主要是DNA复制中一条链上经修复系统改正的变化）。
突变有自发和诱发两种，其表现是：只有基因型改变而无表型改变（DNA多态性和个体差异的基础）、表型改变（遗传病和遗传倾向性的病的原因）和致死性突变。在复制过程中自然发生的突变几率极低，约为10-9，而外界因素引起的诱变研究不断深入，其形式有：错配（点突变）、缺失、插入和倒位。
点突变指DNA分子上一个碱基的改变；缺失指一个碱基或一段核苷酸序列从DNA分子上消失；插入指一个或一段原来没有的核苷酸序列插入到DNA分子中间；倒位指DNA链内较大片段的重组（反置或内迁）。
物理因素多见于紫外线照射，引起DNA分子结构中出现嘧啶二聚体。化学因素主要有烷化剂、亚硝酸盐和抗生素及类似物。前两者引起DNA分子中碱基改变，后者能嵌入DNA双螺旋的碱基对之间，干扰和影响DNA的复制与转录。
二、DNA损伤的修复
DNA损伤和修复，是细胞内DNA复制中同时并存的两个过程。修复（repairing）是针对已发生的DNA损伤施行补救，可看作很小范围内的DNA合成。主要有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复等。
1.光修复 
从单细胞生物到鸟类都有光复合酶，可见光使该酶激活，并催化分解因紫外线照射而产生的嘧啶二聚体，使DNA损伤得以恢复。
2.切除修复 
这是机体细胞内DNA损伤的主要修复方法。由特异的核酸内切酶、DNA-polＩ、DNA连接酶完成。其过程是：核酸内切酶水解核酸链内损伤部位的磷酸二酯键，造成一个缺口；DNA-polＩ在3′-OH端按碱基配对原则催化合成新的DNA片段，置换出的片段还由DNA-polＩ切除；DNA连接酶完成最后的修复。
着色性干皮病（xeroderma pigmentosis，XP）是一种人类遗传性皮肤病，DNA修复能力的缺陷可能是病因。患者对日光异常敏感，其皮肤受照射后，易诱发皮肤癌。
3.重组修复 
当DNA分子损伤面较大，来不及修复就复制。其损伤部位失去模板作用，造成子链上的缺口，通过链间交换，可填补这缺口，而母链上的缺口由DNA-pol和DNA连接酶完成修复。原有的损伤部位还在，但随多次复制，损伤链所占比例减少。
4.SOS修复 
当DNA损伤严重，细胞处在危急状态下的一种修复方式。这种修复反应特异性低，DNA保留的错误较多，会引起突变，但细胞尚可存活。

第四节  基因重组与DNA克隆
一、基因重组
DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组或基因重组。重组产物称为重组DNA。DNA的重组广泛存在于各类生物。其功能：①在DNA损伤修复中起关键作用，没有重组，损伤和突变不会被消除。②重组和转座产生基因新的组合，供自然选择。③调节DNA表达。
20世纪60年代末，在细菌体内陆续发现一类能识别DNA的特异序列，且在识别序列内或附近切开DNA双链的核酸水解酶，称为限制性核酸内切酶（简称限制酶）。这类酶可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速切开，进而被脱氧核糖核酸酶水解，有防止病毒感染宿主细胞的作用。而对细菌自身的DNA则会通过甲基化酶在该种限制酶切位点的甲基化修饰而得到保护。所以，限制酶和甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。
限制酶是一类重要的工具酶，到1999年10月已得到3154种，主要根据其来源菌株，依属、种、株三字母命名，若从同一微生物发现的多种限制酶，则依发现和分离前后的顺序用罗马数字表示。根据限制酶识别切割特性和催化条件有Ｉ、Ⅱ、Ⅲ型，重组DNA中常用的是Ⅱ型。限制酶只有限制性内切作用而无修饰功能，识别序列一般有4~6个碱基对，多数能识别廻文结构DNA序（具有二次旋转对称性）。例如大肠杆菌DNA限制酶EcoRⅠ的切口是交错的，产生能彼此配对的粘端（sticky end），切口是齐头的，产生平端（blund end）。由同一个限制酶切断得到的任何两个DNA片段的粘性末端都可以互相配对，再通过DNA连接酶连接，创建重组DNA分子。
1972年，美国学者Berg等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA用限制性内切酶分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。
1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。由此诞生基因工程这门新兴学科。
二、DNA克隆
克隆（clone）是指通过无性繁殖产生在基因型和表型上与亲代完全相同的子代群体。DNA克隆是指在体外对DNA分子按照既定目的分离、剪切和人工重组，然后将重组分子导入合适的宿主细胞，使其扩增的过程。
大部分外源DNA片段不能在细胞中自我复制，必须连到一个可以自主复制的载体（病毒或质粒DNA）上，然后转入宿主细胞复制。这样，外源DNA可以纯化形式重新获得大量拷贝。因在分子水平上操作，又称分子克隆。由于研究对象常是特异的基因片段，所以又称基因克隆。
基因载体（vector）是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内复制或表达的运载工具。其基本条件是：能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制；具有一个以上的单一限制性酶切位点，以便目的基因插入；具有合适筛选标记（如抗药性基因，酶基因等）；载体分子量小，可插入较大的目的基因而不影响复制；在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。
质粒（plasmid）是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子。主要存在于微生物，细菌中含量最丰富。质粒控制多种不同的遗传性状，尤其与细菌的抗药性、致病性有关。
λ-噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称cos位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λ-DNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。天然的质粒、噬菌体、病毒都需经人工改构才可为理想的载体。质粒、噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，动物病毒常用于真核细胞为宿主的分子克隆。
三、聚合酶链式反应（PCR）
PCR是一种体外快速的特定DNA片段扩增技术。Mullis于1985年发明，其基本原理是根据DNA复制机制及DNA在体外随温度发生变性和复性的特点设计的。
一个PCR反应包括靶DNA（含目的DNA的样品）、引物（人工合成的与靶DNA的3′端序列互补杂交）、4种dNTP和热稳定的DNA聚合酶等。然后置高温950C（15~30秒）下使靶DNA变性解链，反应混合物被迅速冷却（单链DNA与引物结合的退火温度要认真计算，45~550C），再升高温度置70~750C左右，由TDNA聚合酶催化引物延伸合成子链。PCR的高温变性—低温退火—适温延伸三步反应反复循环，使靶DNA在两段引物限定范围内的序列以几何级数扩增。20个循环，起始DNA即扩增百万倍，30个循环后，扩增亿倍，全部所需时间不到1小时。PCR已广泛应用于生物学各个领域，如基因工程、DNA测序、筛选人类遗传疾病、病原微生物检测、法医学鉴定等。
概括起来，基因工程（genetic engineering）包括以下几个主要内容：
1.从复杂的生物体基因组中分离出目的基因片段。
2.在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。
3.将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞（又称受体细胞），并与之一起增殖。
4.筛选出获得重组DNA的受体细胞克隆。
5.从筛选出的阳性克隆中提取扩增的目的基因片段，供研究。
6.将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之实现功能表达。

 
第十章  RNA的生物合成(转录)

教学目标：
1.掌握转录的概念和转录体系的组成。
2.熟悉原核生物转录的基本过程。比较真核生物的转录与原核生物不同。
3.了解RNA转录后加工的方式（内含子、外显子、核酶的概念）。
4.了解RNA复制的概念。
导入：从生物化学意义上说，基因(gene)是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物是各种RNA和蛋白质。基因表达包括细胞的遗传信息从DNA到RNA，再由RNA到蛋白质。前者称为转录，后者称为翻译。

第一节 转录
一、转录的概念和特点
转录（transcription）是DNA指导下的RNA合成过程，即DNA模扳的碱基序转抄成RNA的碱基序列。转录和复制有许多相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；都按模板链的碱基配对原则和5′→  3′方向在核苷酸之间生成磷酸二酯键，且延伸新链。不同的是：
1.不对称转录 
转录不像复制要保留细胞的全部遗传信息，而是在细胞不同的发育时序，按生存条件和生理需要，部分遗传信息（结构基因）的表达。所以转录对基因组庞大的DNA链有选择性，这种选择是不对称的（asymmetric）。即DNA分子中进行转录的某一活化基因区段称模板链（template strand），与其对应的互补链不转录，称编码链（coding strand）。对各种基因来说，模板链并非总在同一条单链上。
2.RNA聚合酶（又称DNA指导的RNA聚合酶，DDRP）
该酶广泛存在于原核生物和真核生物中，以4种NTP为底物，无需引物，直接在模板上合成RNA链。
原核生物中所有的RNA都由一种RNA聚合酶合成。大肠杆菌RNA- pol分子量为460kDa，由5个亚基组成，分别为α2、β、β＇、σ。α2ββ＇称为核心酶，只能使已开始合成的RNA链延长，不具有起始合成RNA的能力，σ因子有识别转录起始位点的作用。启动转录只有全酶与模板DNA启动子结合才发挥作用。
真核生物RNA- pol有多种，分子量大致都在500kDa左右。
DDRPⅠ分布在核仁，合成rRNA前体
DDRPⅡ分布在核质，合成mRNA，hnRNA
DDRPⅢ分布在核质，合成tRNA，5SrRNA，snRNA
线粒体RNA聚合酶合成线粒体RNA
二、转录过程
转录是包括起始—延伸—终止的连续过程。原核生物的转录和真核生物的转录在起始和终止上有较多的不同。
（一）启动子和起始
启动子（promoter）是指RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列。
原核启动子发现有两个重要序列，一个位于转录起始位点上游10个核苷酸处（习惯上被转录为RNA的DNA模板上的第一个核苷酸指定为+1，即转录起始位点），另一个位于上游35个核苷酸处，它们分别称为－10序列和–35序列。－10序列富含TATAAT，称之TATA box或Pribnow box。该序列富含AT，维持双链结合的氢键相对较弱，易发生解链，是RNA聚合酶的核心酶结合部位。－35序列富含TTGACA，是RNA聚合酶σ亚基的识别部位。实验可知原核生物RNA聚合酶作用的区域为－50~+20。
在转录起始阶段，RNA聚合酶识别将拷贝的基因的上游DNA（即启动子），局部解开双链（特别是TATA box处，约17个bp），当酶移至转录起始位点（+1处），催化按模板链碱基序依次排列的头两个三磷酸核苷聚合，生成RNA链的第一个3′，5′-磷酸二酯键，第一个核苷酸一定是三磷酸嘌呤核苷酸，而且pppG较pppA又占绝对优势，5′-端的pppG这一末端结构一旦生成，一直保持到转录完成。
（二）延伸
转录起始后，RNA聚合酶、DNA模板以及第一个聚合生成的四磷酸二核苷酸（即5′pppGpN-OH3′）三者形成一个复合体，此时σ亚基脱落（与另一核心酶结合而重复使用），核心酶沿DNA链的3′→5′方向移动（转录方向），而RNA链按5′→3′方向延伸。由RNA聚合酶、DNA模板和新生RNA组成的区域叫做“转录泡”（transcription bubble）。新生RNA与DNA模板链暂时形成短的杂交双链（长度约为12bp），这有利于正确阅读模板链的碱基序，但A=U配对稳定性最低。在延伸阶段约有DNA的20个bp被解开，延伸速率约每秒50个核苷酸，在此时间内转录泡移动17.0nm。当RNA从DNA上脱离，暂时局部解开的双链及时复合。