同尾酶（isocaudamers）
识别序列不同，可以产生相同的粘性末端。
星号活性
指限制酶在一定的因素作用下酶切识别的特异性降低的现象。星号活性的出现会导致酶切位点的增多、片段增多。星号活性的引起与多种因素有关，如甘油浓度、其它有机试剂的存在、pH值或离子强度不适及有的酶本身容易出现星号活性。
II.问答题
1.使用工具酶应注意什么？
答：（1）保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml，对维持酶在反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（组分V）是一种很好的可加入酶反应液的中性蛋白质，它的使用终浓度应该为0.1mg/ml。
（2）提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应该尽量使反应在接近Km的条件下进行。
（3）应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度和离子强度。
2.简要介绍反转录酶（活性和种类）。
答：反转录酶是由反转录病毒编码合成的。当病毒RNA包装成病毒颗粒感染新的细胞时，反转录酶的作用是将病毒RNA基因组复制成DNA以便于病毒基因整合至宿主基因组中。
    反转录酶有两种活性：
DNA聚合酶活性――在病毒的生活周期中，反转录酶只是以RNA为模板进行复制，但是用在实验中，它以同样的效率以单链RNA或单链DNA为模板进行转录复制。
RNaseH活性――核糖核酸酶，其作用是从RNA-DNA杂交双链分子上降解RNA。
3. 反转录常用引物？
答：寡核苷酸脱氧胸苷（oligo(dT)）,模板3’端的序列有可能被过量拷贝，从而在cDNA中所占比例过大，这取决于反转录酶的质量及反应条件。
    随机序列的寡核苷酸，旨在使用序列极为多样的一个寡核苷酸集群，以期至少有一些寡核苷酸与模板退火并作为反转录的引物；
    特定序列的寡核苷酸，作为合成与某一段特定的mRNA相对应的cDNA的引物。
4. 连接反应的一般原则是什么？
答：为了获得最大效率的连接，反应体系越小越好，一般10μl；
    连接反应中，载体和插入的目的片段的摩尔比一般为1：1或1：3。DNA浓度约为10ng/μl。


九．基因工程
I.问答题
1.什么是穿梭质粒？
答：所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。
2.黏粒的结构特点及优越性？
答：黏粒英文cosmid，指带有黏端位点(cos)的质粒。黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨卡青霉素抗性标记、cos位点。
黏粒有4个特点：
①具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。
②具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。
③克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般只有5～7kb，而最大的克隆片段可达45 kb左右。
④能与有同源序列的质粒进行重组。

3. 病毒载体的种类及各自特点？
答：逆转录病毒载体：逆转录病毒是一种RNA病毒，基因组大小在8～11kb之间；逆转录病毒基因组RNA在逆转录酶的作用下逆转录出双链DNA，双链DNA能够随机整合到寄主细胞的染色体上，随着寄主细胞的复制而复制。
优点：宿主细胞广泛；能高效感染分裂细胞，感染率高达100％；外源基因完全整合到宿主细胞染色体上。
     缺点：不能感染非分裂细胞；可能产生具有复制能力的病毒；由于随机整合，可能会引起“插入突变”；包装外援DNA能力有限，小于8kb；要求靶细胞表面要具有逆转录病毒的相应受体。
慢病毒载体：慢病毒属于逆转录病毒的一个属，同一般的逆转录病毒相比，慢病毒能够有效感染并整合到分分裂细胞和最终分化的细胞。
腺病毒载体：腺病毒为线性双链DNA病毒，基因组为30~36kb；病毒DNA并不整合到宿主细胞染色体上，而是以染色体外成分存在；目前应用较为广泛的是Ad5。
    优点：人类是腺病毒的天然宿主，所以比较安全；该病毒体外稳定，易于制备与纯化；宿主范围广，既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；腺病毒载体容量大；腺病毒无需整合到宿主细胞基因组中，整合突变致癌可能性小；
    缺点：它几乎可以感染所有细胞，因此缺乏特异性；因不能整合到宿主染色体上，所以不能持续表达所需产物，表达时间短暂，需重复给予制剂治疗；因可能刺激免疫反应，使反复治疗的效果会逐渐降低。
腺相关病毒载体：为单链DNA病毒，基因组在4.7～6之间，他的复制依赖于辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒；腺相关病毒位点特异性整合，能高效整合到人类19号染色体的特定区域。
    优点：目前尚未发现该病毒在人体中致病，比较安全；感染宿主细胞广泛，包括非分裂细胞和分裂细胞，特别是能够感染神经元和神经胶质细胞；能特异整合于人的第19号染色体长臂末端，减少了突变的可能性；外源基因表达稳定；
    缺点：难以大量生产，复制需要辅助病毒，并且包装外源基因的能力有限。
4. 什么是STS,EST,contig？
答：STS是序列标记位点（sequence-tagged site）的缩写，是指染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只有一份拷贝的DNA短片断，一般长200bp－500bp。它可用PCR方法加以验证。将不同的STS依照它们在染色体上的位置依次排列构建的图为STS图。在基因组作图和测序研究时，当各个实验室发表其DNA测序数据或构建成的物理图时，可用STS来加以鉴定和验证，并确定这些测序的DNA片段在染色体上的位置；还有利于汇集分析各实验室发表的数据和资料，保证作图和测序的准确性。
STS（Sequence-Tagged Site, STS）序列标签位点 是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA 序列，，用于产生作图位点，即测定一系列STS 的次序即可作出基因组区域的图谱。STS主要包括简单重复序列（Simple Sequence Repeat Polymorphisms, 简称SSR或SSRP）、锚定简单重复序列（ Anchored Simple Sequence Repeats, ASSR）、序列特异扩增区域（Sequence-characterized amplified regions）、酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences, CAPS）、单引物扩增反应（Single Primer Amplification Reaction, SPAR）等标记技术。
EST是表达序列标签（expressed sequence tag）的缩写，在人类基因组测序工作中，有一个区别于"全基因组战略"的"cDNA战略"，即只测定转录的DNA序列。此时，须从cDNA文库中获取一些长为300－400各碱基序列作为表达序列标签，其作用相当于全基因组测序时的序列标记位点（STS），即可用来验证和整理不同实验室发表的cDNA测序资料。两端又重叠序列的EST可以装配成全长的cDNA序列。特定的EST序列有时可代表特定的cDNA。
contig就是重叠群的意思。就是基因组分析测序中的一个概念。
把含有STS序列标签位点的基因片段分别测序后，重叠分析就可以得到完整的染色体基因组序列。分析中的用到的一个概念就是重叠群。
物理图谱的制作，可以更好的理解这个概念：
基本原理是把庞大的无从下手的DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作为图距，以DNA探针的STS（sequence tags site）序列为路标。1998 年完成了具有52,000个序列标签位点(STS)，并覆盖人类基因组大部分区域的连续克隆系的物理图谱。构建物理图的一个主要内容是把含有STS对应序列的DNA的克隆片段连接成相互重叠的“片段重叠群（contig）”。用“酵母人工染色体(YAC)作为载体的载有人DNA片段的文库已包含了构建总体覆盖率为100%、具有高度代表性的片段重叠群”，近几年来又发展了可靠性更高的BAC、PAC库或cosmid库等。
5.cDNA文库的构建？
答：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，在体外经过逆转录过程产生出双链cDNA，然后再克隆到载体中，转化受菌体，经过繁殖扩增，就形成cDNA文库
6.如何实现一个外源基因在体外的表达。